RT Dissertation/Thesis
T1 Caracterización citogenética de bivalvos veneroideos y algunos de sus parásitos
T2 Cytogenetic characterization of veneroid bivalves and some of their parasites
A1 Garcia Souto, Daniel
K1 2409 Genética
K1 2407.02 Citogenética
AB Los bivalvos son un grupo de moluscos exclusivamente acuícolas caracterizados por presentarun cuerpo comprimido lateralmente cuyas partes blandas están recubiertas por una concha (Gosling2015). Las más de 8500 especies aceptadas en la actualidad según el World Register of Marine Species(WoRMS, http://www.marinespecies.org/) se distribuyen por todo el planeta ocupando ecosistemas tantomarinos como salobres y, en menor medida, de agua dulce. Los bivalvos incluyen un buen número deespecies de gran interés económico y juegan un papel ecológico fundamental en ambientes bentónicos.Los bivalvos son, además, hospedadores intermediarios de digeneos parásitos, que pueden llegar a tenerun enorme impacto en poblaciones, tanto naturales como de cultivo, de bivalvos.Si bien la clasificación de los bivalvos es un tema bastante controvertido y análisis filogenéticosrecientes (Bieler et al. 2014) proponen la existencia de seis linajes monofiléticos en la clase Bivalvia,WoRMS todavía usa cuatro subclases, Protobranchia, Pteriomorphia, Paleoheterodonta, y Heterodonta.La subclase Heterodonta incluye más de dos tercios de los bivalvos actuales y es extremadamente diversaen cuanto a forma, tamaño, anatomía y hábitos de vida y las filogenias moleculares más recientes hanconstatado que algunos de los órdenes, superfamilias y familias incluidos en ella son grupos para opolifiléticos (Bieler et al. 2014). Debido a ello, su taxonomía está en continua revisión. Un buen ejemplode esta situación es el tradicional orden Veneroida que en la actualidad ya no se considera nimorfológicamente homogéneo ni monofilético y, por tanto, es cuestionado a pesar de su enormeimportancia pues engloba algunas de las familias con mayor número de especies descritas (Veneridae,680 especies; Mactridae, 180; Donacidae, 100; Tellinidae, 500) (Huber 2010, 2015).La mayoría de los estudios cromosómicos en bivalvos se limitan a la descripción del númerocromosómico y el cariotipo organizado en función de la morfología y el tamaño de los parescromosómicos (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994). Los análisis de este tipo realizados a lo largodel pasado siglo llevaron a proponer que los números cromosómicos eran relativamente estables dentro decada familia de bivalvos y que se agrupaban en torno a los 2n = 20 habituales en Ostreidae, los 2n = 28 deMytilidae y Pteridae y los 2n = 38 de la mayoría de las restantes familias, incluida Veneridae (ThiriotQuiévreux1994). No obstante, el incremento en el número de especies analizadas ha demostrado quealgunas familias y géneros de bivalvos presentan especies con distintos números cromosómicos.Esto no parece ser el caso en la subclase Heterodonta puesto que la inmensa mayoría de lasespecies analizadas son 2n = 38. Además, los cariotipos de estas especies suelen presentar cromosomasen los que morfología y tamaño muestran escasas diferencias (Nakamura 1985; Thiriot-Quiévreux 1994,2002). Esta homogeneidad dificulta la identificación de pares cromosómicos concretos y hace que lashomologías cromosómicas interespecíficas descritas sean una suposición. Así pues, a fin de comparar loscariotipos de bivalvos en general y de veneroideos en particular, es necesario explorar otras metodologías,entre ellas las técnicas de bandeo cromosómico o la hibridación in situ fluorescente (FISH).En bivalvos se han mapeado mediante FISH genes rRNA 45S en unas 50 especies, genes rRNA5S en unas 25, genes de las histonas del núcleo en 15, genes de las histonas de unión en seis y secuenciasteloméricas en unas 25 (Thiriot-Quiévreux 2002; Leitão y Chaves 2008; Petrović et al. 2009; PérezGarcíaet al. 2010a, 2010b, 2011, 2014a, 2014b; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al.2011; González-Tizón et al. 2013; Li et al. 2016; García-Souto et al. 2017). Estas técnicas hanposibilitado el establecimiento de cariotipos más fiables y una mejor comprensión de los cambioscromosómicos que han acompañado su evolución (Pérez-García et al. 2014b) pero también hancontribuido a entender mejor sus filogenias. Además, la aplicación de estas técnicas en especies de estasfamilias ha permitido comprobar que frente a la presunta conservación cariotípica que se deducía trasaplicar técnicas citogenéticas clásicas, la situación cromosómica de estas secuencias puede presentarvariaciones considerables. Por ejemplo, las especies atlánticas de ostras se diferencia de sus congénerespacíficas por la posición de los genes rRNA 45S, demostrando que incluso cariotipos aparentemente muyconservados muestran divergencias (Wang et al. 2004). A estos mismos grupos se refiere la mayoría delas localizaciones cromosómicas de DNA satélites en bivalvos (Clabby et al. 1996; Wang et al. 2001;Martínez-Lage et al. 2002; Cross et al. 2005; Odierna et al. 2006; Biscotti et al. 2007; Bouilly et al. 2008;López-Flores et al. 2010; Hu et al. 2011; Petraccioli et al. 2015).En Heterodonta la aplicación de técnicas de mapeo cromosómico es todavía más escasa. Hasta lafecha se han localizado mediante FISH los genes rRNA 45S en 18 especies, los genes rRNA 5S en 9, losgenes de las histonas del núcleo en 2 y secuencias teloméricas en 12 (Insua et al 1999; González-Tizón etal. 2000; Wang y Guo 2001, 2007, 2008; Martínez et al. 2002; Plohl et al. 2002; Fernández-Tajes et al.2003, 2008; Hurtado y Pasantes 2005; Petrović et al. 2009; Bouilly et al. 2010; Carrilho et al. 2011; Hurtado et al. 2011; González-Tizón et al. 2013; Pérez-García et al. 2014a). Casi todas estas especies son2n = 38 y sus cariotipos relativamente similares pero presentan considerables diferencias en ladistribución cromosómica de estas secuencias, demostrando, por tanto, su interés como marcadores paradeducir relaciones de parentesco evolutivo. Por lo que se refiere a ADN satélites, las únicas especies de lasubclase Heterodonta en las que se han localizado este tipo de secuencias son la almeja fina, Ruditapesphilippinarum (Passamonti et al. 1998) y la coquina, Donax trunculus (Petrović et al. 2009).Si los estudios citogenéticos en bivalvos son escasos, todavía lo son mucho más en trematodosdigeneos. Pese a ser el grupo mayoritario de metazoos endoparásitos con más de 18000 especies, sólo sehan descrito números cromosómicos y cariotipos en unas 300 y se han localizado mediante FISHsecuencias teloméricas y/o genes de los rRNA 45S en 9 (Hirai et al. 1989, 2000; Baršiené 1993; Hirai yLo Verde 1996; Bell et al. 1998; Petkevičiūtė et al. 2003; Špakulová y Casanova 2004; Reblánová et al.2011; Zadesenets et al. 2012a, 2012b; Petkevičiūtė et al. 2012, 2014, 2015; Hirai 2014; Sofi et al. 2015).Por ello, para incrementar el conocimiento citogenética en especies de Veneroida y de algunosde los trematodos digeneos que las parasitan, analizamos los cromosomas de 20 especies de Veneridae(Ruditapes philippinarum, R. decussatus, Venerupis corrugata, Clausinella fasciata, Chamelea gallina,C. striatula, Venus verrucosa, Venus casina, Dosinia exoleta, Dosinia lupinus and Petricola litophaga),Mactridae (Spisula subtruncata, S. solida and Mactra stultorum), Donacidae (Donax trunculus and D.vittatus) y Tellinidae (Bosemprella incarnata, Macomangulus tenuis, Moerella donacina and Serratinaserrata) y de 10 taxones de parásitos digeneos, Bucephalus minimus, B. australis, Prosorhynchoidescarvajali (Bucephaloidea), Monascus filiformis (Gymnophalloidea), Parorchis acanthus(Echinostomatoidea), Cryptocotyle lingua (Opisthorchioidea), Cercaria longicaudata, Monorchis parvus(Monorchioidea), Diphterostomum brusinae y Bacciger bacciger (Microphalloidea) aislados a partir de12 moluscos que actúan como huéspedes intermedios. La aproximación general consistió en aplicardiversas combinaciones de fluorocromos base-específicos (4’-6-diamidino-2-phenylindol DAPI, DNArico en AT; cromomicina A3, CMA, DNA rico en GC) e inespecíficos (ioduro de propidio, PI), bandas Ce inmunodetección de 5-methyl-cytosine además de mapear sondas de DNA repetido (rDNA 45S y 5S,genes de histonas, secuencias telomericas y DNA satélites) sobre sus cromosomas.Se obtuvieron preparaciones cromosómicas utilizando métodos previamente publicados (Méndezet al. 1990; Pasantes et al. 1990). Después de tratar los bivalvos con colchicina, se diseccionaronbranquias y gónadas y se sumergieron en agua de mar al 50% y al 25% antes de fijarlas en una mezcla deetanol y ácido acético. Las paralarvas de digeneos fueron tratadas del mismo modo. En ambos casos lasmuestras ya fijadas fueron desagregadas en una disolución de ácido acético al 60% hasta obtenersuspensiones celulares que se dejaron caer gota a gota sobre portaobjetos precalentados a 50 °C.La tinción con fluorocromos se llevó a cabo tal y como describen Pérez-García et al. (2010b).Después de controlar su calidad mediante microscopía de contraste de fases (Nikon), las preparacionesfueron teñidas con CMA (0.25 mg/mL), contrateñidas con DAPI (0.14 g/mL), lavadas en agua corriente,se dejaron secar al aire y se montaron (Vectashield, Vector). Las preparaciones se estudiaron yfotografiaron mediante microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse-800). Se tomaron imágenesseparadas para cada fluorocromo con una cámara CCD DS-Qi1Mc (Nikon) controlada con el programaNIS-Elements (Nikon). La superposición de las imágenes se realizó con Adobe Photoshop. Tras serfotografiadas, las preparaciones se retiñeron con una combinación de DAPI y PI (0.07 g /mL), selavaron en agua corriente, se dejaron secar al aire, se montaron y se volvieron a fotografiar.La extracción de DNA se realizó mediante cloroformo/isoamilalcohol o con el EZNA MolluscDNA Kit (OMEGA). En los casos necesarios se amplificaron por PCR fragmentos del gen COImitocondrial usando los cebdores LCO1490 y HCO2198 (Folmer et al. 1994). Para amplificar unfragmento del gen rRNA 16S mitocondrial se usaron los cebadores 16L29 (Schubart et al. 2001) y 16SBr(Palumbi 1996). El segmento ITS2 del rDNA 45S se amplificó con los cebadores ITS3 e ITS4 (White etal. 1990). Para su uso como sondas FISH, se utilizaron los cebadores universales LR10R y LR12(Vilgalys lab website, http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) para amplificar unfragmento del 28S rDNA. Para amplificar el 5S rDNA y el gen de la histona H3 se usaron los cebadoresdescritos por Pérez-García et al. (2010a, 2010b) y por Giribet y Distel (2003), respectivamente.Las secuencias de DNA se amplificaron (GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems) envolúmenes de 50 µL que contenían 125 ng de DNA genómico, 50M de cada dNTP, 50 M de cadacebador, 1x tampón de PCR, 15 M de MgCl2 y 5 U de JumpStart™ Taq DNA Polymerase (Sigma). Las amplificaciones incluyeron una desnaturalización inicial a 95 ºC (2 min), 35 ciclos de amplificación y unaextensión final a 72 °C (5 min).Las secuencias amplificadas fueron purificadas (FavorPrepTM GEL/PCR Purification Kit,Favorgen) y secuenciadas (CACTI, Universidad de Vigo) en ambos sentidos en un ABI PRISM 3730Genetic Analyzer (Applied Biosystems) usando un BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems). Las secuencias se editaron con BioEdit v. 7.1.11 (Hall 1999) y se alinearon conMuscle usando los parámetros por defecto en MEGA7 (Kumar et al. 2016). Se realizaron búsquedas desecuencias con el algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), disponible en el NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Se empleó elalgoritmo MegaBLAST, con parámetros por defecto, para comparar las secuencias con las existentes enlas bases de datos del NCBI y del Barcode of Life Data System (BOLD).Los cromosomas se hibridaron con sondas de rDNA 5S y 28S y de genes de la histona H3(Pérez-García et al. 2011). La sondas 28S rDNA se marcaron con biotina-16-dUTP (Roche AppliedScience) o digoxigenina-11-dUTP (10x DIG Labeling Mix, Roche Applied Science) usando un kit denick translation (Roche Applied Science). Las sondas para el gen de la histona H3 y para el rDNA semarcaron directamente por PCR con biotina-16-dUTP (20 M) o digoxigenina-11-dUTP (5 M).Las preparaciones recibieron tratamientos con RNasa y pepsina, se desnaturalizaron (70 ºC, 2min) y se hibridaron a 37 ºC. La biotina fue detectada con avidina conjugada con isotiaocianato defluoresceína (FITC) y anti-avidina biotinilada (Vector). La digoxigenina se detectó con anticuerpos antidigoxigeninaconjugados con isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) (Sigma). Una vezcontrateñidas con DAPI, se montaron y se examinaron al microscopio. Se tomaron imágenes para cadafluorocromo por separado, se seudocolorearon y se superpusieron de la manera indicada más arriba.También se realizaron experimentos FISH utilizando una sonda telomérica (C3TA2)3 péptido nucleica(PNA) (Applied Biosystems) siguiendo el protocolo indicado por el suministrador.Se realizaron análisis cromosómicos y cariotipicos sobre un mínimo de 10 ejemplares porespecie (5 machos, 5 hembras). Para cada especie, se construyeron cariotipos a partir de un mínimo de 10metafases completas con señales de FISH y se midieron en ellas las longitudes de los brazoscromosómicos. A partir de estos datos se calcularon longitudes relativas e índices centroméricos.En concordancia con datos previos, todas las especies aquí estudiadas poseen 2n = 38 y suscariotipos suelen estar formados por cromosomas que muestran una distribución de longitudes cuasicontinua. En 16 de las 20 especies las regiones ricas en GC coincidieron con los NORs pero las cuatrorestantes, Donax trunculus, D. vittatus, Mactra stultorum y Spisula subtruncata, presentaron bandasintercalares adicionales. Además, se identificó un nuevo DNA satélite como el componente principal dela heterocromatina rica en GC de S. subtruncata. Como predice la library hypothesis, este DNA satélitetambién fue detectado en M. stultorum y S. solida, mostrando en ellas una gran conservación de lasecuencia pero una drástica reducción en el número de copias. Se determinó también el grado demetilación de este satélite mediante secuenciación genómica con bisulfito e inmunodetección de 5-metilcitosinay los resultados se compararon con los detectados mediante polimorfismos de amplificaciónsensible a la metilación (MSAP) y ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Lametilación del satélite fue alta para lo habitual en bivalvos y triplicó la media de metilación del genomade S. subtruncata.En relación al mapeo mediante FISH, los patrones de distribución de las agrupaciones de genesde la histona H3, del rDNA 5S y del rDNA 45S en especies de Veneroida presentaron algunaspeculiaridades. En la familia Veneridae se identificaron un total de 18 loci para las agrupaciones de genesde histona H3 en las 11 especies analizadas. En seis de las especies apareció una única agrupaciónmientras que Chamelea striatula presentó cuatro y las cuatro especies restantes dos. Quince de estos locison subterminales, dos intercalares y el restante subcentromérico. Excepto Chamelea striatula todas estasespecies presentaron una única agrupación 45S rDNA. Por el contrario, para el 5S rDNA sólo aparecióuna única localización en cinco especies, dos en otras cinco especies y tres en la restante, Petricolalitophaga. Las señales aparecieron en cromosomas distintos salvo en Clausinella fasciata y Chameleastriatula en las que un único par era portador de agrupaciones de genes de histonas y de rDNA, yRuditapes decussatus con señales 5S rDNA y 45S rDNA solapantes.El número y la localización de estas agrupaciones, unido al análisis de las secuenciasnucleotídicas de fragmentos del gen de la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI) y del rDNA 16S mitocondriales y el espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del rDNA 45S nuclear, permitió determinar elestatus taxonómico de las chirlas Chamelea gallina y C. striatula. La comparación de ejemplaresprocedentes de cuatro poblaciones atlánticas y mediterráneas mostró claras diferencias entre ellas. Laconstancia en la distribución de las agrupaciones rDNA 5S y la variabilidad en las del rDNA 45S y de losgenes de histonas en C. gallina y C. striatula fueron de una magnitud similar a las de Venus casina y V.verrucosa y las de Dosinia exoleta y D. lupinus. Al contrario, aunque se detectaron pequeñas diferenciasintraespecíficas tanto en C. gallina como en C. striatula éstas fueron mucho menores que entre taxones ysimilares a las mostradas por otras especies de bivalvos. La comparación de las secuencias nucleotídicasconfirmó que estos taxones son especies diferentes.En Mactridae las agrupaciones 45S rDNA son subterminales en las tres especies. Tanto Spisulasolida como Mactra stultorum presentaron dos agrupaciones para el 45S rDNA en los brazos cortos delos pares 17 and 19 y en los brazos largos de los pares 3 y 4, respectivamente. La única agrupaciónencontrada en Spisula subtruncata se encuentra en el brazo largo del par 18. Las tres mactras presentanuna única agrupación 5S rDNA, subterminal en el brazo corto del par 5 en Spisula solida y en el brazolargo del par 3 en Spisula subtruncata, e intercalar en el brazo corto del par 15 en Mactra stultorum. Apesar de que también hay una única agrupación de genes de histona H3 en las tres especies, suslocalizaciones difieren, intercalar en el brazo largo del par subtelocéntrico 8 en Spisula solida y del 12en Mactra stultorum pero subcentromerico en el brazo largo del par metacentrico 14 en Spisulasubtruncata.Las coquinas presentaron agrupaciones de genes de la histona H3 intercalares en el brazo largodel par 17, subtelocentrico en D. trunculus y telocentrico en D. vittatus. El rDNA 45S es intercalar en elbrazo corto del par 6, subtelocéntrico en D. trunculus. La mayoría de los ejemplares de D. vittatuspresentan el rDNAs 45S en el brzo corto del par 6 que en este caso es telocéntrico. Por el contrario, elrDNA 45S es subcentromerico en el brazo largo del par 6, metacéntrico, en todos los especímenes de D.vittatus recolectados en Samil. El número de agrupaciones rDNA 5S es diferente en D. trunculus y D.vittatus. En ambas especies hay una agrupación subterminal en el brazo largo del par subtelocéntrico 10pero D. trunculus presenta también una segunda agrupacion en el brazo corto del par metacéntrico 2. Lasdiferencias cariotípicas pudieran ser fundamentalmente debidas a inversiones pericéntricas.Como en las otras familias, las telinas también presentaron diferencias en número y localizaciónde las agrupaciones rDNA 45S, rDNA 5S y de genes de la histona H3. Macomangulus tenuis, Moerelladonacina y Bosemprella incarnata portan un único rDNA 45S mientras que Serratina serrata presentados. Con respecto al rDNA 5S, también aparecen especies con una (B. incarnata and S. serrata) o dos(M. tenuis and M. donacina) agrupaciones. Por el contrario, las cuatro especies muestran una únicaagrupación de genes de la histona H3, aunque situados en lugares diferentes.En las especies de tremátodos digeneos estudiadas, los números diploides variaron desde unmínimo de 2n = 12 en B. bacciger a un máximo de 2n = 22 en P. acanthus. Estos parásitos tambiénmostraron grandes diferencias en la morfología de sus cromosomas. Mientras que los cariotipos de C.lingua y P. acanthus se componen de cromosomas exclusivamente metacéntricos y subtelocéntricos,respectivamente, el resto de los taxones presentó diversas combinaciones de tipos cromosómicos. Todaslas especies presentaron una única agrupación del rDNAs 45S y otra del 5S aunque la localización fuediferente. En B. minimus and P. acanthus ambos rDNAs aparecen en pares cromosómicos distintosmientras que en las restantes especies las señales solapan en un único par. Los experimentos medianteFISH también permitieron probar la existencia de regiones DAPI negativas, muy descondensadas,coincidentes con el rDNA 45S. Las señales para el 45S rDNA aparecen en la cromatina condensada queflanquea esas regiones y que no son verdaderos telómeros pues carecen de señales teloméricas. Lapresencia de regiones subcentroméricas de ese tipo en B. australis, P. carvajali, P. acanthus, C. lingua,M. parvus, y B. bacciger, provoca que una tinción sencilla con DAPI diese números cromosómicosaparentemente superiores a la dotación diploide. En los taxones restantes, B. minimus, M. filiformis, C.longicaudata y D. brusinae, muchas de las metafases mitóticas mostraron constricciones secundariasclaramente DAPI negativas que separaban un pequeño fragmento de cromatina del resto del cromosoma.En este estudio también se detectaron de 1 a 19 cromosomas B en los ejemplares de B. bacciger aisladosde Ruditapes decussatus. Estos cromosomas metacéntricos supernumerarios presentan señalesteloméricas en ambos extremos y se caracterizan por mostrar brazos largos fuertemente teñidos conDAPI, evidentes también en los núcleos interfásicos.
YR 2017
FD 2017-08-04
LK http://hdl.handle.net/11093/765
UL http://hdl.handle.net/11093/765
LA eng
NO Xunta de Galicia
DS Investigo
RD 13-dic-2024