Fish pigmentation : functional and evolutionary characterization of the agouti locus

Abstract

Pigment pattern formation is a classic problem in developmental biology and has been the subject of extensive experimental investigation and mathematical modelling. Vertebrate pigment patterns frequently show a clear distinction between a pale ventral area and a darker dorsal area. Thanks to the work of Greg Barsh’s lab, we have known for some time that in mammals this pattern results from spatially regulated expression of Agouti-signaling protein. The molecular basis of pigment pattern has also been widely studied in fish, but to date the emphasis has been exclusively on the mechanisms controlling striped and spotted patterns in zebrafish and its sister species. However, fish also show a pronounced dorsal-ventral pigment pattern. In this PhD dissertation, we show that the dorsal-ventral patterning in zebrafish is also Agouti-signaling protein-dependent, and that the striping mechanism is largely independently superimposed upon this evolutionarily-conserved dorsal-ventral patterning mechanism. Our observations are, we believe, the first to show a “loss-of-function” mutation of the signaling molecule (Agouti-signaling protein, Asip1) and its receptor (Mc1r) and to demonstrate that disruption of their expression abolishes the dorsal-ventral pigment pattern difference. Combined with the data from mammals, our data strongly suggests that an Agouti-signaling protein-dependent mechanism regulating dorsal-ventral pigment pattern is a conserved feature of vertebrates, so that other patterning mechanisms, whether generating stripes or spots or other patterns, are likely generated by superimposing secondary patterning mechanisms. Our conclusion is particularly interesting because the cellular basis for the patterns in mammals (and birds) and in fish appear very different, with the former depending on a shift in the biochemistry of melanin produced within melanocytes, whereas the latter seems to affect the ratios of black melanocytes and other pigment cell-types, the yellow xanthophores and the silver iridophore. Our data indicates that at the cellular level there is some conservation of the mechanisms, with Asip1 and Mc1r affecting melanin production (total levels, not melanin type), but also likely affecting the ratio of pigment cell types in different body regions. Additionally, the results of this PhD project unquestionably confirmed the pleiotropic nature of the agouti gene. Thus, this reveals the ability of the melanocortin system to simultaneously regulate pigmentation and other physiological processes in fish skin. Finally, our results also provide evidence that the mechanism leading to the dorsal-ventral pigment pattern pre-dates the origin of teleosts. Lastly, we have to say that this work has been a cross-disciplinary and combined cutting-edge approaches from comparative genomics, cell and developmental biology, reverse genetics, and evolutionary biology. Overall, we feel this thesis not only provide basic knowledge on vertebrate pigmentation development, but also provide information relevant to the design of new strategies for intensive fish culture.

La presencia de anomalías pigmentarias es un factor crítico en la viabilidad económica del cultivo y comercialización de peces planos. Se desconoce el motivo de la elevada incidencia de malformaciones pigmentarias en el cultivo de peces planos, siendo muy probable que resulte de complejas interacciones entre factores genéticos y ambientales. Para tener un mayor conocimiento de las interacciones genético-ambientales es necesario tener en cuenta los mecanismos epigenéticos. Así, el campo interdisciplinar de la epigenómica ambiental pone de relieve la posible influencia de los factores nutricionales y ambientales en la regulación epigenética de la expresión de diferentes genes, ya sea durante el desarrollo larvario, en fase de adulto o entre generaciones, dando lugar a numerosas alteraciones fenotípicas, tales como cambios en la pigmentación. Recientemente, en nuestro laboratorio hemos demostrado que el gen Agouti (ASP) esta implicado en el control de la pigmentación en el pez cebra y en el rodaballo. Sin embargo, no conocemos la regulación molecular de dicho proceso, lo que hace difícil solucionar el problema. Por consiguiente, el objetivo fundamental de este proyecto es llevar a cabo un estudio integrado para evaluar la regulación molecular de la pigmentación en peces. Más concretamente, el trabajo se centra en el estudio de la regulación del gen ASP, del que previamente hemos demostrado que juega un papel clave en la pigmentación. Los objetivos específicos del proyecto consisten en la caracterización molecular y funcional del gen ASP en peces y en el estudio de los efectos epigenéticos de las dietas sobre la función del gen ASP y en consecuencia, sobre las anomalías en el patrón de pigmentación. Por consiguiente, el diseño experimental se ha dividido en dos bloques experimentales. Un primer bloque centrado en la caracterización molecular y funcional del gene ASP y un segundo bloque enfocado a la determinación de los efectos de la dieta en la regulación epigenética del gene ASP y en consecuencia, sobre las anomalías en el patrón de pigmentación. El trabajo se realizará mediante el uso de dos especies: el pez cebra, organismo que está universalmente aceptado como un modelo para el estudio genético y epigenético de la expresión de los genes durante el desarrollo y, en rodaballo, una especie de elevado interés comercial. De esta manera, el proyecto se distribuye en dos fases: la primera empleando el pez cebra, dirigida a obtener información genética y epigenética de la regulación de la pigmentación en peces. La segunda fase del proyecto se centra en aplicar el conocimiento procedente de los estudios realizados en el pez cebra para solucionar las malformaciones pigmentarias observadas mayoritariamente en los rodaballos de cultivo. Los resultados esperados no solo proporcionarán información relevante para el diseño de nuevas estrategias para el cultivo intensivo de peces, si no que también ofrecerán un conocimiento básico acerca del desarrollo pigmentario de vertebrados. Así, con este proyecto se pretende poder transferir nuevos conocimientos, tecnología e información desde áreas en las que se ha realizado una gran inversión (genómica-epigenómica) hacia áreas de investigación aplicada consiguiendo un uso rentable y sostenible de las herramientas obtenidas.

A presenza de anomalías pigmentarias é un factor crítico na viabilidade económica do cultivo e a comercialización de peixes planos. Desconócese o motivo da elevada incidencia de malformacións pigmentarias no cultivo de peixes planos, sendo moi probable que resulte de complexas interaccións entre factores xenéticos ambientais. Para ter un maior coñecemento das interaccións xenético-ambientais é preciso ter en conta os mecanismos epixenéticos. Así o campo interdisciplinar da epixenómica ambiental pon de manifesto a posible influencia dos factores nutricionais e ambientais na regulación epixenética da expresión de diferentes xenes, tanto na fase de desenvolvemento larvario, na fase de adulto ou entre xeracións, dando lugar a numerosas alteracións fenotípicas, tales como cambios na pigmentación. Recentemente, no noso laboratorio demostramos que o xen Agouti (ASP) está implicado no control da pigmentación no pez cebra e no rodaballo. Sen embargo, non coñecemos a regulación molecular de dito proceso, o que fai difícil solucionar o problema. Por conseguinte, o obxectivo fundamental deste proxecto é levar a cabo un estudo integrado para evaluar a regulación molecular da pigmentación en peixes. Máis concretamente, o traballo céntrase no estudo da regulación do xen ASP, do que previamente demostramos que xoga un papel clave na pigmentación. Os obxectivos específicos do proxecto consisten na caracterización molecular e funcional do xen ASP en peixes e no estudo dos efectos epixenéticos das dietas sobre a función do xen ASP e en consecuencia, sobre as anomalías no patrón de pigmentación. Por conseguinte, o deseño experimental dividiuse en dous bloques experimentais. Un primer bloque centrado na caracterización molecular e funcional do xen ASP e un segundo bloque enfocado na determinación dos efectos da dieta na regulación epixenética do xen ASP e en consecuencia, sobre as anomalías no patrón de pigmentación. O traballo realizarase mediante o uso de dúas especies: o pez cebra, organismo que está universalmente aceptado como un modelo para o estudio xenético e epixenético da expresión dos xenes durante o desenvolvemento e, no rodaballo, unha especie de elevado interese comercial. Deste xeito, o proxecto distribúese en dúas fases: a primeira empleando o pez cebra, dirixida a obter información xenética e epixenética da regulación da pigmentación en peixes. A segunda fase do proxecto céntrase en aplicar o coñecemento procedente dos estudos realizados no pez cebra para solucionar as malformacións pigmentarias observadas maioritariamente nos rodaballos de cultivo. Os resultados agardados non só proporcionarán información relevante para o deseño de novas estratexias para o cultivo intensivo de peixes, se non que tamén ofrecerán un coñecemento básico acerca do desenvolvemento pigmentario de vertebrados. Así, con este proxecto preténdese poder transferir novos coñecementos, tecnoloxía e información dende áreas nas que se ten realizado unha gran inversión (xenómica-epixenómica) cara áreas de investigación aplicada conseguindo un uso rendible e sostible das ferramentas obtidas.