DATE:
2023-09-29
UNIVERSAL IDENTIFIER: http://hdl.handle.net/11093/5193
SUPERVISED BY: Correa Duarte, Miguel Ángel
; Pereira Fernandes, Rúben Miguel
; Ferreira, Maria Goreti Sales


DOCUMENT TYPE: doctoralThesis
ABSTRACT
Radiotherapy (RT) is one of the most widely used approaches to treating patients with prostate cancer (PC) . There are two major limitations of this technique: the difficulty in delineating the contours of tumor volume for the planning and problems associated with the mechanisms of radioresistance of the tumor cells that result from mutations and disorders of gene expression.
One of the major regulatory mechanisms of gene expression occurs in the post-transcriptional stage by mRNA degradation by microRNAs and has an important role in the pathogenesis of cancer.
The main objective of this project is to develop nanoparticles (NPs) that incorporate miRNA, that allow to improve the diagnosis by Computed Tomography (CT) in the planning phase of the treatment and simultaneously allow the radiosensitization of PC3 and LNCaP tumor cells to radiotherapy.
In this study, it is expected to alter the sensitivity of tumor cells to ionizing radiation through miRNAs and to potentiate an increase in the therapeutic effect of radiotherapy.
THE FIRST TASK (1.) of this project consists of developing metallic NPs, so that the gold NPs (AuNPs) and the iron NPs (FeNPs) capable of offering a teranesthetic application will be used. NPs will be synthesized that will transport miRNAs associated with radiosensitivity and the drug (19). Initially, two miRNAs will be used, mir-145 and mir-521. For the development of this stage, several tasks will be performed:
i) Synthesis of metallic NPs;
ii) Loading NPs.
In the SECOND TASK, it is intended to promote the functionalization of NPs and the intelligent release of miRNAs and drug in the tumor target, which will be mediated by the chemical characteristics of the NPs surface. In this context, plastic antibodies (Molecularly Imprinted Polymer - MIP) will be synthesized which will coat the metal NPs and will be responsible for increasing affinity for the therapeutic target.
Generally, the strategy used is to include a bulk impression surface of the target protein of the EGFR/HER2 family, which exists on the outer surface of the PC tumor cells. The target protein may be altered in light of new data in the literature. Surface imprinting is best for an organized structure, however, it may fail when proteins lack a spherical shape, since many of them may be coated by polymeric material (making it difficult to form annealing positions).
The THIRD TASK (3) comprises in evaluating the impact of miRNAs on the biology of the tumor cell and following the procedures already performed by our research group, so that cell cultures will be performed on PC-3 and LNCaP prostate lines and the following points:
i) Cell viability assay;
ii) Apoptosis Assay by Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dUTP Nick end Labeling (TUNEL);
iii) Bromodeoxyuridine proliferation assay (BrdU);
iv) Determination of cell distribution and adhesion;
v) Injury assay;
vi) Formation of the SOFT-AGAR colony. La radioterapia (RT) es uno de los enfoques más utilizados en el tratamiento de pacientes con cáncer de próstata (CP). Hay dos grandes limitaciones de esta técnica: la dificultad en la delineación de los contornos del volumen tumoral para la planificación y problemas asociados a mecanismos de radiorresistencia de las células tumorales, que resultan de mutaciones y disturbios de expresión génica.
Uno de los principales mecanismos reguladores de la expresión génica ocurre en la fase post-transcripcional por degradación del mRNA por microRNAs y tienen un importante papel en la patogénesis del cáncer.
El objetivo principal de este proyecto consiste en desarrollar nanopartículas que incorporen miRNA, que permitan mejorar el diagnóstico por Tomografía computarizada (TC) en la fase de planificación del tratamiento y simultáneamente permitan la radiosensibilización de células tumorales PC3 y LNCaP a la radioterapia.
En este estudio, se espera alterar la sensibilidad de las células tumorales a la radiación ionizante a través de los miRNAs y potenciar un aumento del efecto terapéutico de la radioterapia.
La PRIMERA TAREFA (1.) de este proyecto consiste en desarrollar NPs metálicas, por lo que se utilizarán las NPs de oro (AuNPs) y las NP de hierro (FeNPs) capaces de ofrecer una aplicación teranóstica. Se sintetizan NPs que transportarán mi ARNs asociados a la radiosensibilidad y el fármaco (19). Inicialmente, se utilizarán dos miRNAs, el mir-145 y el mir-521. Para el desarrollo de esta etapa, se realizarán varias tareas:
i) Síntesis de NPs metálicas;
ii) Carga de las NPs.
En la SEGUNDA TAREFA, se pretende promover la funcionalización de las NPs y la liberación inteligente de miRNAs y fármaco en el blanco tumoral, que será mediada por las características químicas de la superficie de las NPs. En este contexto, se sintetizan los anticuerpos plásticos (Molecularly Imprinted Polymer - MIP) que van a revestir las NPs metálicas y serán responsables por el aumento de la afinidad hacia el objetivo terapéutico.
En general, la estrategia utilizada consiste en incluir una superficie de impresión a granel de la proteína objetivo de la familia EGFR/HER2, que existe en la superficie externa de las células tumorales de CP. La proteína objetivo puede ser alterada a la luz de nuevos datos en la literatura. La impresión de la superficie es mejor para una estructura organizada, sin embargo, puede fallar cuando las proteínas no poseen una forma esférica, ya que muchas de ellas pueden ser revestidas por el material polimérico (dificultando la formación de posiciones de reconexión).
La TERCERA TAREFA (3.) comprende en evaluar el impacto de los miRNA en la biología de la célula tumoral y siguiendo los procedimientos ya ejecutados por nuestro grupo de investigación, por lo que se realizarán cultivos celulares en líneas de próstata PC-3 y LNCaP y se analizarán los siguientes puntos:
i) Ensayo de la viabilidad celular;
ii) Ensayo de la apoptosis por Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa dUTP Nick end Labeling (TUNEL);
iii) Ensayo de la proliferación Bromodeoxiuridina (BrdU);
iv) Determinación de la distribución y la adhesión de las células;
v) Injury asay;
vi) Formación de la colonia SOFT-AGAR.