Functional analyses and novel markers for Pulmonary Arterial Hypertension

Abstract

Pulmonary Arterial Hypertension (PAH) is a rare disease characterized by progressive obliteration of the pulmonary precapillary arteries, leading to an increase in pulmonary vascular resistance that causes right heart failure, and subsequently, death. In the last decade, mass sequencing has increased the number of genes involved in PAH, doubling the number of known genes. This quantitative increase in the available data has shown low efficiency in classifying variants, resulting in high levels of variants of uncertain significance, which show as a problem for both diagnosis and genetic counseling. To improve the classification of variants into PAH-related genes, we will perform functional studies in new genes (ABCC8) and others with broad known involvement but no functional analysis (TBX4). The ABCC8 gene encodes for the regulatory subunit of an ATP-dependent potassium channel known as SUR1, which needs binding to the pore-forming protein Kir6, the involvement of this channel in diseases such as diabetes is known, but as it fits exactly into the pathogenesis of PAH it is for now diffuse. ABCC8 is a gene of complex structure, consisting of 39 small exons with broad intronic regions. Due to these characteristics, most of the mutations found in the Spanish HAP registry (REHAP), are found in the vicinity of regions bordering exons and introns. To determine whether these seemingly change-of-direction mutations can induce exon jump events, we will make minigenes for 11 variants detected in REHAP. On the other hand, TBX4 is one of the genes with the greatest involvement in pediatric PAH, although in recent years the proportion of variants in adult forms has increased considerably. The function of TBX4 is well known in embryonic development, but its role in adults is not. For this reason, we collected 51 variants in TBX4 for their functional study, by analyzing their transcriptional activity and cell location, as well as minigenes for the cut and splice variants. At present, the diagnosis of PAH is produced using invasive and expensive means that require the hospitalization of the patient, no marker allows the diagnosis quickly and easily. In the last decade the use of circulating microRNAs (miRNAs) as biomarkers has begun to be proposed, miRNAs are small non-coding RNA molecules of 16-22 base pairs that regulate posttranscriptional activity by binding to the 3 'UTR region of messenger RNA. stable in the blood and their levels in this fluid are affected in pathological processes. Which makes them potential biomarkers for countless diseases, such as PAH, which due to the processes of remodeling, proliferation and inhibition of apoptosis that occurs in endothelial cells and smooth muscle of the pulmonary precapillary arteries, makes it a strong candidate for the development of a model for its diagnosis based on circulating miRNAs. To perform this model, microRNA-Seq will be used, from total RNA from patient plasma and controls. Initially a differential expression analysis will be done, and then the results will be validated using qPCR using specific probes. Once we have a set of miRNAs with differentiated expression between the two groups, a variable number of miRNAs will be proposed for prevalence in a cohort belonging to REHAP, to finally be validated in 100 PAH patients and 100 controls using digital droplet PCR. Machine learning methods will be used to assess different combinations of circulating miRNAs. Besides, the effect of more deregulated miRNAs will be assessed in vitro using arterial endothelial cells.

A Hipertensión Arterial Pulmonar (HAP) é unha enfermidade rara caracterizada pola obliteración progresiva das arterias precapilares pulmonares, conducindo a un aumento da resistencia vascular pulmonar que provoca insuficiencia cardíaca dereita, e posteriormente, a morte. Na última década a secuenciación masiva permitiu aumentar o número de xenes implicados na HAP, duplicando o número de xenes coñecidos. Este aumento cuantitativo dos datos dispoñibles evidenciou baixa eficiencia para clasificar variantes, obtendo niveis altos de variantes de significado incerto, que amosan coma un problema para tanto á hora de diagnosticar coma dar consello xenético. Co obxectivo de mellorar a clasificación de variantes en xenes relacionados coa HAP, faremos estudos funcionais en xenes novos (ABCC8) e outros con ampla implicación coñecida pero sen análises funcionais (TBX4). O xene ABCC8 codifica para a subunidade reguladora dunha canle de potasio dependente de ATP coñecida como SUR1, que precisa da unión coa proteína formadora de poro Kir6, a implicación desta canle en enfermidades como a diabetes é coñecida, pero como encaixa exactamente na patoxénese da HAP é por agora difuso. ABCC8 é un xene de estrutura complexa, formado por 39 exóns de pequeno tamaño con rexións intrónicas amplas. Debido a estas características, a maior parte das mutacións atopadas no rexistro español de HAP (REHAP), atópanse en proximidade de rexións limítrofes entre exóns e intróns. Co obxectivo de determinar se estas mutacións aparentemente de cambio de sentido poden chegar a inducir eventos de salto de exóns, faremos minixenes para 11 variantes detectadas no REHAP. Por outra banda, TBX4 é un dos xenes con maior implicación en HAP pediátrica, aínda que nos últimos anos a proporción de variantes nas formas adultas aumentou considerablemente. A función de TBX4 é ben coñecida no desenvolvemento embrionario, pero o seu papel nos adultos non. Por este motivo, recompilamos 51 variantes en TBX4 para o seu estudo funcional, mediante a análise da súa actividade transcricional e localización celular, ademais de minixenes para as variantes de corte e empalme. Na actualidade, o diagnóstico da HAP prodúcese utilizando medios invasivos e custosos que esixen o internamento do paciente, non existe ningún marcador que permita o diagnóstico dunha forma rápida e sinxela. Nesta última década comezouse a propor o uso de microARNs (miRNAs) circulantes como biomarcadores, os miRNAs son pequenas moléculas de ARN non codificante de 16-22 pares de bases que regulan a actividade postranscricional uníndose á rexión 3’ UTR do ARN mensaxeiro, son moi estables no sangue e seus niveis neste líquido vense afectados nos procesos patolóxicos. O que os converte en biomarcadores potenciais para infinidade de enfermidades, coma a HAP, que debido aos procesos de remodelación, proliferación e inhibición da apoptose que ocorre nas células endoteliais e do músculo liso das arterias precapilares pulmonares, vólvea unha firme candidata para o desenvolvemento dun modelo para a súa diagnose baseado nos miRNAs circulantes. Para realizar este modelo utilizarase a microRNA-Seq, a partir de ARN total provinte de plasma de pacientes e controles. Nun primeiro momento farase unha análise de expresión diferencial, e despois, os resultados validaranse mediante qPCR utilizando sondas específicas. Unha vez teñamos un conxunto de miRNAs con expresión diferenciada entre ambos grupos, propoñerase un número variable de miRNAs para a súa prevalidación nunha cohorte pertencente ao REHAP, para poder finalmente facer unha validación en 100 doentes de HAP e 100 controis utilizando droplet digital PCR. Para valorar distintas combinacións de miRNAs circulantes utilizaranse métodos de machine learning. Ademáis, o efecto dos miRNAs máis desregulados sen función coñecida avaliarase in vitro utilizando células de endotelio arterial.

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad rara caracterizada por la obliteración progresiva de las arterias precapilares pulmonares, lo que lleva a un aumento de la resistencia vascular pulmonar que provoca insuficiencia cardíaca derecha y, posteriormente, la muerte. En la última década, la secuenciación masiva ha aumentado el número de genes implicados en la HAP, duplicando el número de genes conocidos. Este incremento cuantitativo de los datos disponibles ha mostrado una baja eficiencia en la clasificación de variantes, resultando en altos niveles de variantes de significado incierto, que se muestran como un problema tanto para el diagnóstico como para el consejo genético. Con el fin de mejorar la clasificación de variantes en genes relacionados con la HAP, realizaremos estudios funcionales en genes nuevos (ABCC8) y otros con implicación conocida, pero sin análisis funcionales (TBX4). El gen ABCC8 codifica para la subunidad reguladora de un canal de potasio dependiente de ATP conocido como SUR1, que necesita unirse a la proteína formadora de poros Kir6, la participación de este canal en enfermedades como la diabetes es conocida, pero cómo encaja exactamente en la patogénesis de la HAP es por ahora un enigma. ABCC8 es un gen de estructura compleja, que consta de 39 exones pequeños con amplias regiones intrónicas. Por estas características, la mayoría de las mutaciones encontradas en el registro español de HAP (REHAP), se encuentran en las proximidades de regiones limítrofes entre exones e intrones. Con el fin de determinar si estas mutaciones aparentemente de cambio de sentido pueden inducir eventos de salto de exón, crearemos minigenes para las 11 variantes detectadas en la REHAP. Por otro lado, TBX4 es uno de los genes con mayor implicación HAP pediátrica, aunque en los últimos años la proporción de variantes en formas adultas ha aumentado considerablemente. La función de TBX4 está bien caracterizada durante el desarrollo embrionario, pero su papel en adultos no está claro. Por esta razón, recopilamos 51 variantes en TBX4 para su estudio funcional, analizando su actividad transcripcional y ubicación celular, así como minigenes para las variantes de corte y empalme. En la actualidad el diagnóstico de HAP se produce mediante medios invasivos y costosos que requieren la hospitalización del paciente, no existe ningún marcador que permita el diagnóstico de una manera rápida y sencilla. En la última década se ha comenzado a proponer el uso de microARN circulantes (miARN) como biomarcadores, los miARN son pequeñas moléculas de ARN no codificantes de 16-22 pares de bases que regulan la actividad postranscripcional uniéndose a la región 3 'UTR del ARN mensajero, son muy estables en sangre y sus niveles en este líquido se ven afectados en procesos patológicos. Lo que los convierte en potenciales biomarcadores de innumerables enfermedades, como la HAP, que debido a los procesos de remodelación, proliferación e inhibición de la apoptosis que se producen en las células endoteliales y el músculo liso de las arterias precapilares pulmonares, los convierte en buenos candidatos para el desarrollo de un modelo para su diagnóstico basado en miARN circulantes. Para realizar este modelo, se utilizará microRNA-Seq a partir de ARN total de plasma de paciente y controles. Inicialmente se realizará un análisis de expresión diferencial y luego se validarán los resultados mediante qPCR utilizando sondas específicas. Una vez que tengamos un conjunto de miRNAs con expresión diferencial entre ambos grupos, se propondrá un número variable de miRNAs para hacer una prevalidación en una cohorte perteneciente al REHAP, para finalmente hacer una validación en 100 pacientes con HAP y 100 controles mediante droplet digital PCR. Se utilizarán métodos de machine learning para evaluar diferentes combinaciones de miARN circulantes. Además, el efecto de miARN más desregulados sin función conocida se evaluará in vitro utilizando células endoteliales.