Impacto de los fungicidas sobre el metabolismo de las levaduras vínicas y su implicación en la biosíntesis de compuestos volátiles responsables del aroma

Abstract

Los principios activos de los tratamientos antifúngicos aplicados durante el cultivo de la uva pueden ser transferidos al mosto y, a pesar de reducirse durante el proceso de vinificación, pueden permanecer a niveles residuales en el vino final. La presencia de estos residuos en el mosto, aunque por debajo de sus Límites Máximos Residuales (LMRs) marcados por la legislación europea para uva de vinificación (Reglamento 396/2005 y posteriores modificaciones), podría llegar a influir en la calidad organoléptica de los vinos. Así, el metabolismo de las levaduras puede sufrir alteraciones como consecuencia de la situación de estrés originada por la exposición a residuos de fungicidas durante la etapa de crecimiento, pudiendo retrasarse el inicio de las fermentaciones o incluso producirse paradas fermentativas (Cabras y col., 1987). Por otro lado, dado que las levaduras desempeñan un papel crucial en la formación de los principales compuestos volátiles responsables de la base aromática de los vinos, y en el caso de las levaduras del género Saccharomyces, llegan incluso participar en la liberación de aromas primarios a través de enzimas glucosidasas (Gamero y col., 2014), los residuos de fungicidas pueden afectar a las rutas de biosíntesis de compuestos aromáticos y, alterar, consecuentemente, el perfil sensorial de los vinos (González-Álvarez y col., 2012). Durante la fermentación, las levaduras emplean los nutrientes presentes en el mosto para su desarrollo y crecimiento. El mosto contiene compuestos aromáticos que se encuentran bien en forma libre (olorosos por si mismos) y otros en forma ligada (no volátiles; precursores del aroma). Dentro de los precursores del aroma, podemos distinguir aquellos compuestos específicos (glicosídicos, cisteínicos y glutatiónicos) que pueden originar volátiles olorosos mediante una o dos fragmentaciones de la molécula, quedando aún reconocible la estructura de su precursor (Salinas y col., 2013) y los compuestos inespecíficos, como es el caso de la mayor fuente nitrogenada del mosto: los aminoácidos, precursores metabólicos de los principales compuestos del vino, además de ácidos grasos y carotenoides. El contenido en nitrógeno, en cualquiera de sus formas químicas, orgánica (aminoácidos, péptidos y proteínas) e inorgánica (ión amonio) es muy variable, dependiendo de distintos factores como la variedad de uva, su grado de maduración, características edafoclimáticas y diversos aspectos tecnológicos del proceso de vinificación (Mas y col., 2013). El nitrógeno desempeña un papel importante en muchas de las funciones y procesos biológicos, como el crecimiento y división celular de las levaduras y la biosíntesis de compuestos aromáticos (alcoholes superiores y ésteres de acetato) a través del metabolismo secundario de las levaduras, concretamente mediante la vía catabólica denominada ruta de Ehrlich (descarboxilación y posterior reducción de los α-cetoácidos obtenidos por transaminación de los aminoácidos) (Ayräpää, 1971). Todo lo expuesto hasta ahora, evidencia la triple interacción entre la composición del sustrato fermentable (mosto), levadura empleada y presencia de residuos de fungicidas sobre la biosíntesis de compuestos aromáticos. Sin embargo, en este momento, los mecanismos moleculares de sobreexpresión/represión genética mediante los cuales los fungicidas provocan dichos cambios, no se conocen con exactitud. El principal objetivo del presente proyecto es proporcionar un mayor conocimiento sobre la influencia de los fungicidas habitualmente empleados en el cultivo de la vid sobre el transcurso del proceso fermentativo y el metabolismo secundario de las levaduras y, por lo tanto, sobre el perfil aromático de los vinos obtenidos.

Os principios activos dos tratamentos antifúnxicos aplicados durante o cultivo da uva poden ser transferidos ao mosto e, a pesar de verse reducidos polo proceso de vinificación, poden permanecer a niveis traza no viño final. A presenza destes residuos no mosto, aínda que por baixo dos seus Límites Máximos Residuais (LMRs) marcados pola lexislación europea para uva de vinificación (Regulamento 396/2005 e posteriores modificacións), podería chegar a influír na calidade organoléptica dos viños. Así, o metabolismo dos lévedos pode sufrir alteracións como consecuencia da situación de estrés orixinada pola súa exposición a residuos de funxicidas durante a etapa de crecemento, podéndose retrasar o inicio das fermentacións ou incluso producirse paradas fermentativas (Cabras e col., 1987). Por outra banda, dado que os lévedos desempeñan un papel crucial na formación dos principais compostos volátiles responsables da base aromática dos viños, e no caso dos lévedos do xénero Saccharomyces chegan a participar na liberación de aromas primarios a través de enzimas glucosidasas (Gamero e col., 2014), os residuos de funxicidas poden afectar ás rutas de biosíntese de compostos aromáticos e, alterar, consecuentemente, o perfil sensorial dos viños (González-Álvarez e col., 2012). Durante a fermentación, os lévedos empregan os nutrientes presentes no mosto para o seu desenvolvemento e crecemento. O mosto contén compostos aromáticos que se atopan ben en forma libre (olorosos per se) ou en forma ligada (non volátiles; precursores do aroma). Dentro dos precursores do aroma, pódense distinguir aqueles compostos específicos (glicosídicos, cisteínicos e glutatiónicos) que poden orixinar volátiles olorosos mediante unha ou dúas fragmentacións da molécula, quedando aínda recoñecible a estrutura do seu precursor (Salinas e col., 2013) e os compostos inespecíficos, como é o caso da maior fonte nitroxenada do mosto, os aminoácidos (precursores metabólicos dos principais compostos aromáticos do viño), ademais de ácidos graxos e carotenoides. O contido en nitróxeno, en calquera das súas formas químicas, orgánica (aminoácidos, péptidos e proteínas) e inorgánica (ión amonio) é moi variable, dependendo de distintos factores como a variedade de uva, o seu grao de maduración, características edafoclimáticas e diversos aspectos tecnolóxicos do proceso de vinificación (Mas e col., 2013). O nitróxeno desempeña un papel importante en moitas funcións e procesos biolóxicos, como o crecemento e división celular dos lévedos e a biosíntese de compostos aromáticos (alcohois superiores e ésteres de acetato) a través do metabolismo secundario dos lévedos, concretamente mediante a vía catabólica denominada ruta de Ehrlich (descarboxilación e posterior redución dos α-cetoácidos obtidos por transaminación dos aminoácidos) (Ayräpää, 1971). Todo o exposto até o de agora, evidencia a tripla interacción entre a composición do substrato fermentable (mosto), o lévedo empregado e a presenza de residuos de funxicidas sobre a biosíntese de compostos aromáticos. Sen embargo, neste momento, os mecanismos moleculares de sobreexpresión/represión xenética mediante os cales os funxicidas provocan ditos cambios, non se coñecen con exactitude. O principal obxectivo do presente proxecto é proporcionar un maior coñecemento sobre a influenza dos funxicidas habitualmente empregados no cultivo da vide sobre o transcurso do proceso fermentativo e o metabolismo secundario dos lévedos e, polo tanto, sobre o perfil aromático dos viños obtidos.

The active substances of antifungal treatments applied during grape cultivation, can be transferred to the must and, despite being reduced during the winemaking process, may remain at small levels in the final wine. The presence of this residues in the must, although still present below their Maximum Residual Limits (LMR) as set by European legislation for vinification grapes (regulation 396/2005 and later amendments), could produce changes in the organoleptic quality of the wines. Thus, the metabolism of yeasts may be altered by exposure to stressful situations such as the presence of fungicides during the growth stage and as a result, it is possible to slow down the beginning of the fermentations or to produce stops in the fermentation process (Cabras et al., 1987). On the other hand, due to the yeasts have a key role in the biosynthesis of aromatic compounds responsible of aromatic base of wines and, in the case of Saccharomyces yeasts, they even participate in the release of primary aromas through glucosidase enzimes (Gamero et al., 2014), the fungicide residues can affect the biosynthetic routes of aromatic compounds and, alter, consequently, the aromatic profile of wines (González-Álvarez et al., 2012). During fermentation process, yeasts use the nutrients present in grape juice for their development and growth. The must contains aromatic compounds that are free form (odorous by themselves) and others in a linked form (non-volatile; aroma precursors). Belonging to precursors of the aroma, it can distinguish those specific compounds (glycosidic, cysteinic and glutationic) that can cause odorous volatiles by one or two fragmentations of the molecule, still recognizable the structure of its precursor (Salinas et al., 2013), and non-specific compounds, as in the case of the largest nitrogen source of the must: the amino acids, metabolic precursors of the main compounds of wine, as well as fatty acids and carotenoids. The nitrogen content, in any of its chemical forma (organic: amino acids, peptides and proteins) and inorganic (ammonium ion) is very variable, depending of maturation, edafoclimatic characteristics and various technological aspects of the winemaking process (Mas et al., 2013). The nitrogen plays a key role in many of the biological functions and processes, as well as the growth and cellular division of the yeasts and the biosynthesis of aromatic compounds (higher alcohols and acetate esters) through secondary metabolism, particularly through the catabolic route named Erhlich (decarboxylation and later reduction of α-ketoacids obtained though transamination of amino acids) (Ayräpää, 1971). Everything exposed up to now, evidences the triple interaction between the composition of the fermentable substrate (must), yeast employed and the presence of fungicide residues on the biosynthesis of aromatic compounds. However, at this time, the molecular mechanisms of genetic overexpression/repression by which fungicides cause such changes are not exactly known. The main objective of this study is to provide greater knowledge about the influence of fungicides commonly used in the cultivation of the vine on the fermentation course and in the secondary metabolism of yeasts and, therefore, on the aromatic profile of obtained wines.