Caracterización biológica de nano-recubrimientos cerámicos para ingeniería biomédica

Abstract

La presente tesis doctoral se centra en la obtención de nano-recubrimientos avanzados con propiedades antibacterianas que supongan un salto cualitativo en las prestaciones de las prótesis e implantes actuales. Se propone aportar un recubrimiento, en el rango nanométrico, como estrategia local para mitigar o reducir la probabilidad de colonización bacteriana de las prótesis, sin perjudicar el adecuado crecimiento de las células presentes en el entorno biológico próximo al implante, mejorando con ello la osteointegración del mismo y, por tanto, su fijación y estabilidad. Para ello se aborda, como primera estrategia, la mejora de la composición de los actuales recubrimientos basados en fostatos cálcicos mediante la incorporación de elementos con propiedades antibacterianas (Cu, Zn, F) y, como segunda estrategia, la funcionalización de la superficie del titanio con un nano-recubrimiento basado en el óxido de grafeno que posibilite el anclaje de compuestos antibacterianos u otras biomoléculas de interés. El abordaje experimental para la obtención de los nano-recubrimientos se realiza, en el primer caso, mediante la técnica denominada Depósito por Láser Pulsado (PLD), utilizando materias primas de origen sintético (hidroxiapatita comercial y óxidos de Cu y Zn) y también de origen biológico (fluorapatita de diente de tiburón). En la segunda estrategia se utiliza un método simple de depósito por goteo y posterior tratamiento térmico de un compuesto de óxido de grafeno sobre la superficie metálica a recubrir. Entrando en detalle, los nano-recubrimientos se han estudiado en cuanto a morfología superficial por microscopía electrónica de barrido (SEM), topografía y espesor por perfilometría interferométrica o propiedades mecánicas por nanoindentación. Las características estructurales se han evaluado mediante difracción de rayos X (XRD) y configuración de enlaces por espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y espectroscopia Raman. Finalmente, la composición elemental de los nanorecubrimientos se ha determinado mediante rayos X por dispersión de energía (EDS) y espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), al igual que el grado de hidrofobicidad por ángulo de contacto. La caracterización biológica se realizó mediante ensayos biológicos con líneas celulares eucariotas (MC3T3-E1, MG63) y estudios microbiológicos con las cepas bacterianas Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Los resultados experimentales han demostrado la viabilidad de obtener nanorecubrimientos mediante ambas estrategias, tanto apatitas dopadas (Cu, Zn, F) como óxido de grafeno reducido, con una respuesta biológica óptima. Entre las conclusiones más específicas cabe destacar que se confirma la incorporación de los elementos minoritarios (Cu, Zn o F) en la estructura apatítica, controlando la concentración del elemento dopante. Se demuestra que tanto el Cu como el Zn se localizan en la red de apatita sustituyendo a iones Ca, modificándose el tamaño de cristal, dando lugar a un aumento de los ratios Cu/Ca y Zn/Ca. En el caso del F se constata que se requiere la presencia de vapor de agua durante el procesamiento de los nano-recubrimientos para favorecer la cristalinidad y una transferencia más eficiente de los elementos minoritarios (F, Na y Mg) y de los grupos CO3 -2 y H2O. Por otra parte, en los nano-recubrimientos de óxido de grafeno se demuestra que un tratamiento térmico en el rango de temperaturas entre 200-400 ºC promueve la reducción parcial del material con ruptura de enlaces C-O y, con ello, un descenso en su grado de hidrofilicidad. Por último, la caracterización biológica de los nano-recubrimientos basados en apatitas dopadas con Cu, Zn y F demostró la viabilidad celular in vitro de los mismos con preosteoblastos MC3T3-E1 y sus propiedades antibacterianas. En este sentido se comprobó la reducción estadísticamente significativa, frente a apatitas sin dopar, del crecimiento de S. aureus sobre los nano-recubrimientos dopados (Cu, Zn y F), de E. coli sobre los nano-recubrimientos dopados con Cu y de S. epidermidis sobre los dopados con F. Se probó, además, cómo la presencia en las apatitas de concentraciones de Cu en un 2% at., Zn en un 0.15% at. y F en un 1.96% at. promueve la síntesis de la enzima fosfatasa alcalina (ALP), marcador temprano de actividad osteogénica, tras 21 días en los tres recubrimientos. Por otro lado, también se constata la viabilidad celular in vitro con células MG63 de los extractos de los nano-recubrimientos de óxido de grafeno reducido y, en definitiva, se demuestra en este trabajo la posibilidad de producir nano-recubrimientos mediante ambas estrategias, tanto apatitas dopadas (Cu, Zn, F) como óxido de grafeno, con una respuesta biológica adecuada, aportando nuevas funcionalidades a las prótesis e implantes actuales.

No presente proxecto de tese abórdase o desenvolvemento de novos biomateriais cerámicos para aplicacións protésicas e enxeñaría de tecidos. A primeira fase consiste na fabricación e caracterización de nanorrecubrimentos de apatitas enriquecidas con elementos traza esenciais orientadas á mellora da osteointegración de prótese e implantes. Avaliarase a súa bioactividade e capacidade osteoinductora mediante cultivos in vitro con osteoblastos, osteoclastos e células endoteliais. Nunha segunda fase, no marco da enxeñaría de tecidos, abordarase a obtención de estadas ou "scaffolds" porosos en 3D para a rexeneración de tecido óseo. Estas estadas basearanse na combinación de apatitas con hidroxeles e alxinatos e servirán como soporte ao crecemento de tecidos baseados nos tipos celulares mencionados anteriormente. O estudo in vitro realizarase en biorreactores, baixo condicións dinámicas de fluxo, simulando a mecánica á que se ve sometido o óso en condicións reais.

In this thesis project we develop new ceramic biomaterials for tissue engineering and prosthetic applications. The first phase consists on the manufacture and characterization of apatites using nanocoatings enriched with essentials of metal trace aimed at improving osseointegration of prostheses and implants. Bioactivity and osteoinductive capacity will be assessed by in vitro culture with osteoblasts, osteoclasts and endothelial cells. In a second phase, under the tissue engineering frame, we will obtain porous scaffolds in 3D for the regeneration of bone tissue. These scaffolds are based on the combination of apatite and alginate hydrogels and serve as support to the growth of the aforementioned cell types. We will perform an in vitro study in bioreactors under dynamic flow conditions, for simulating the bone mechanics inside the body.